原发性痛风家系致病易感基因染色体定位
李长贵1 陈颖1 徐潮2 苗志敏1 闫胜利1宋怀东2
目的：对原发性痛风家系进行致病基因的染色体定位。方法：收集痛风家系成员的临床资料及血液样本。选择其中一典型家系为研究对象（包括6例患者，9例正常人），抽提外周血基因组DNA，进行全基因组扫描和连锁分析，初步明确致病基因所在的染色体区段。结果 在微卫星引物D4S1572处获得最大LOD值（θ=0.00时LOD=1.50），表明该痛风家系的致病基因与该位点连锁。结论 由于D4S1572 位于4号染色体长臂2区5带（4q25），因此该家系致病基因位于4q25附近。
注：国家自然科学基金资助课题（课题编号 30570890）
作者单位：1、青岛大学医学院附属医院内分泌科
2、上海交通大学医学院附属瑞金医院，医学基因组学国家重点实验室
通讯作者：苗志敏 青岛大学医学院附属医院内分泌科
The Primary Gout Susceptibility Gene chromosomal Localization in A Chinese Pedigree
Li chang gui chen ying xuchao miaozhimin yanshengli songhuaidong
Abstract: Objective: To determine chromosomal localization of primary gout susceptibility gene. Methods: The clinical data and the peripheral blood samples were collected in the pedigree members and the genomic DNA was extracted from the blood. A genome-wide screening was performed using 400 micro-satellite DNA markers in this family, and linkage analysis by LINKAGE was used to determine the chromosomal location of the primary gout susceptibility gene .Results: Linkage analysis showed that the maximum LOD score reaches 1.50 at marker D4S1572 ( at recombination fractionθ=0.00 ). Conclusion: Since D4S1572 was localized at 4q25, we roughly localized the primary gout susceptibility gene on 4q25.
Key words primary gout pedigree susceptibility gene chromosomal location
痛风(MIM 138900)是一组与遗传有关的由于嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍所致的异质性疾病，其临床特点为反复发作的急性关节炎，可表现为痛风石、关节强直或畸形、肾实质损害、尿路结石、高尿酸血症等多种慢性症状。原发性痛风约占痛风病人的90%，临床资料显示，该病有明显的家族聚集性，同卵双生子和受累同胞对共显率较高，提示该病有一定遗传背景，但是其遗传模式和致病基因仍不清楚。随着人类基因组计划的完成和分子遗传学技术的发展，遗传性疾病的研究取得了显著进展，许多人类疾病的特异致病基因被识别和克隆。我们研究组通过痛风专病门诊和山东沿海地区痛风和高尿酸血症流行病学调查，收集了56个原发性痛风家系，并与上海第二医科大学人类基因组学国家重点实验室合作，于2005年对其中一个典型的常染色体显性遗传家系进行了全基因组扫描和连锁分析，初步明确了致病基因所在的染色体位置。
研究对象、实验方法和实验结果
——原发性痛风家系致病易感基因染色体定位
研究对象
1、研究对象：我们选择其中一个典型的常染色体显性遗传家系为研究对象。该家系共3代15人，包括6例患者（男性4人，女性2人，年龄21～77岁，平均（43.8±17.83岁），9例正常人，共收集到外周血标本13份。如图1所示，5为先证者，51岁，43岁发病，就诊时血尿酸水平为616umol/L（正常值为＜416umol/L），并有第一跖趾关节疼痛、肿胀、关节发红等临床表现，其父77岁，发病年龄为53岁；其兄弟姐妹中4人发病，发病年龄均在40岁以后，其外甥年龄24岁，发病年龄为23岁（具体资料见表1）。13名家系成员均接受青岛大学医学院附属医院内分泌科医师检查。
2、痛风诊断标准：痛风诊断采用美国风湿病学会的诊断标准。排除继发性痛风后，以下3项中具备任何1项可确诊
（1）关节液中有特异性盐结晶体；
（2）有痛风石；
（3）具备6项：
①、一次以上的急性关节炎发作；
②、炎症表现在1天内达到高峰；
③、单关节炎发作；
④、观察到关节发红；
⑤、第一跖趾关节疼痛或肿胀；
⑦、单侧发作累及跗骨关节；
⑧、有可疑的痛风石；
⑨、高尿酸血症；
⑩、线片：关节内非对称性肿胀,不伴骨质侵蚀的骨皮质下囊肿；
⑾、关节炎发作期间关节液微生物培养阴性。
实验方法
基因组DNA的抽提：采用北京赛百盛公司的DNA抽提试剂盒，从家系中13个关键个体的外周血抽提基因组DNA。
全基因组扫描：采用400对覆盖22对常染色体的微卫星荧光标记引物（ABI PRISM Linkage Mapping Set Version2.5；PE Applied Biosystems，Foster City，CA，U.S.A.），分辨率约为10cM.，对该家系进行全基因组扫描。
PCR反应：根据微卫星标记所扩增片段大小和标记荧光的不同在PTC-225型PCR仪（MJ Research Inc.Waltham，M.A.，U.S.A）上进行多重PCR反应。，反应体系如下：50 ng基因组DNA，每个引物浓度为0.05 umol／L，0.2 mmol／L dNTP。1 uL 10×缓冲液．3.0 mmol／L MgC12和0 4 U HotStar Taq酶，终体积为10 uL。反应条件为：95℃预变性15 min，94 oC变性30 S。55 oC退火30 S，72 oC延伸2 min，10个循环；接着，94oC变性30 S，52 oC退火30 S，72 oC延伸2 min，30个循环；最后72℃延伸15 min。将PCR产物变性后。置于3700DNA测序仪上进行毛细管电泳，等位基因片段大小依靠相对分子质量内标(Gene scan 500LIZ size standard)来判定。采用ABI公司的Genescan（version3.7）和Genotyper （version 3.7）软件来收集和分析数据。
连锁分析：对Genotyper软件的基因分型结果进行人工校对后，采用Linkage软件包(5.2版)中的MLINK程序来计算疾病基因与每个微卫星位点之间的两点LOD值(1og odds score，优势对数分数)。在连锁分析中我们设定该疾病为常染色体显性遗传，疾病基因人群发病概率为1：100 000．假设外显率100％，重组率男女相等。
实验结果
1、痛风家系一般资料（见表1）
父亲为痛风患者，其5个子女中，除小女儿外，余2子2女均为痛风患者。所有痛风患者血尿酸水平均明显高于正常值（397~616umol/L，548.6±102.6）。非痛风患者血尿酸水平在正常范围（191~357umol/L，327.3±95.1）。
2、全基因组扫描结果（见表2）
通过全基因组扫描和连锁分析，在微卫星引物D4S1572处获得最大LOD值（θ=0.00时LOD=1.50），表明该痛风家系的致病基因与该位点连锁，从而初步定位于4号染色体长臂2区5带（4q25）附近。
原发性痛风家系致病易感基因染色体定位
讨论
原发性痛风目前已成为严重危害人类健康的常见病、多发病，该病是一组具有遗传异质性的疾病，由于不同的遗传背景，不同的遗传与环境相互作用方式，迄今其致病基因和遗传模式仍不清楚。通过痛风专病门诊和流行病学调查，我们收集了56个汉族人原发性痛风家系，最近我们对收集到的一个3代6名患者的痛风家系进行了全基因组扫描及连锁分析，结果显示，该家系致病基因位点与微卫星引物D4S1572连锁，在θ=0.00时得到最大LOD值1.50。由于D4S1572位于4号染色体长臂2区5带（4q25），从而将该家系致病基因位点定位于4q25附近。一般认为LOD值为+3或更大时才是两个基因座连锁的确定证据，LOD值在0～2之间只提示可能连锁。虽然对该家系进行连锁分析后所得LOD值仅1.5，但是我们认为，原发性痛风致病基因与该位点连锁，提示其可能位于4号染色体4q25区。这是因为：
（1）所扫描的家系中14人有6名患者，理论最大LOD值为1.6～1.8，实测LOD值（1.5）与最大值非常接近，我们将对该家系进行随访，争取扩大取样人数，并对与该家系特征相似的其他家系进行扫描，有望提高LOD值。
（2）尽管研究对象不同，但Shu- Chuan Cheng等人和本课题组均先后独立的将痛风致病基因定位于4号染色体长臂2区5带，获得最大LOD值的两微卫星引物相距仅4kb。不同种族痛风致病基因位点相近进一步提示在染色体4q25区可能存在痛风的致病基因。
尽管研究对象均为台湾土著居民，但与Shu- Chuan Cheng等人的研究结果不同，Wang WH等人将台湾土著居民痛风家系945人（包括261名患者）致病基因定位于1q21区。其原因可能为原发性痛风为一遗传性异质性疾病，由于基因-基因相互作用，以及环境因素（例如饮食和饮酒）和年龄与性别的影响，其发病机制更加复杂，同一个基因对不同种族和地区的居民所起的作用是不同的。因此即使是同一民族，不同的家系发病也可能由不同的基因所致。
原发性痛风由尿酸代谢障碍（清除过低或生成过多）引起，大部分为多基因遗传病，但是亦存在单基因致病模式，例如由于HGPRT缺乏、PRPP合成酶活性增高、或葡萄糖-6-磷酸酶缺乏所致的嘌呤合成增加，尿酸产生过多。临床研究发现，95%痛风患者为男性，女性多见于更年期后发病。本研究家系第二代个体中5个有4个发病，特别是其3个女儿中有2个发病，且发病年龄均在绝经期前，男女发病均等，提示该家系具有自己的特征，可能为单基因疾病。
在染色体4q25区存在多个基因，其中包括长寿基因，哪个基因是该家系的致病基因，有待于进一步研究。此外，虽然我们初步定位的染色体区域与台湾学者的相同，位点相近，但原发性痛风有明显的遗传异质性，我们和台湾学者克隆的致病基因可能不同，即使为同一基因，突变或SNP位点也可能不同，我们将进一步进行精细定位并选择功能候选基因进行突变和SNP筛查，为最终克隆出原发性痛风的致病基因奠定基础，也为进一步进行该基因的功能研究提供必要的线索和条件。
参考文献
1、Shu-Chuan Cheng L,Chiang SL,Tu HP et al. Genomewide scan for Gout in Taiwanese Aborigines Reveals Linkage to Chromosome 4q25. AM J Hum Genet 2004；75：498-503.
2、贝政平。内科疾病诊断标准[M]。第四版，北京，科技出版社，2001：1239
3、KramerHM,CurhanG.The association between gout and nephrolithiasis:The National Health and Nutrition Examination Survey ,1988～1994.AmJKidney,2002,40(1):37-42.994.
4、方圻,游凯,林其燧,等。中国正常人血尿酸调查及其与血脂的关系.中华内科杂志,1983,22(7):434-438.
5、姜宝法，张源潮，徐晓菲等。山东沿海地区痛风和高尿酸血症的流行病学调查. 中国公共卫生1999,15 (3):502
6、Chen S ,Du H ,Wang Y, et al. The epidemiology study of hyperuricemia and gout in a community population of Huangpu district in Shanghai [J] . Chin Med J , 1998 , 111 :228-230.
7、Wang WH,，Chang SJ，Wang TN et al. Complex segregation and linkage analysis of familial gout in Taiwanese aborigines Arthritis Rheum. 2004 Jan；50(1)：242-246.