改进的肾上腺素自氧化法测定植物SOD酶活性

（普济生物医药集团酶类植物蛋白（SOD）研究中心实验室）

一、 实验原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）在生物体内广泛分布，能催化超氧阴离子自由基(O2-.)发生歧化反应，从而清除氧自由基，起到防御氧毒、抗辐射、抗衰老等作用。

    目前因SOD来源不同测活方法非常多，但是所测酶活结果相差较大、活性单位也不统一。因此，本方法是针对植物型SOD对肾上腺素自氧化法的各种影响因素进行了研究, 建立一种微量、快速、稳定重复性好且适用于植物来源的S O D测定方法。

因植物来源的SOD成分比较复杂，且有微量的多酚抗氧化物成分。肾上腺素是多酚衍生物，在碱性条件下会自动氧化，其中涉及到(O2-.)的链式反应，可被SOD抑制，肾上腺素经多步转化为肾上腺素红。肾上腺素红有480 nm和320nm两个吸收峰。325 nm处的吸收更能灵敏地反映自氧化程度。当pH>10.2，线性范围缩短，pH值越高线性范围越小；pH<10.2 时吸光度值极小，易带入误差。pH10.2 维持着良好的线性段，而且斜率适中，可作为实际应用中的最佳pH。温度在30℃左右，线性关系较好。随着肾上腺素浓度的增加，自氧化速率增大，线性范围增加，当肾上腺素浓度为0.4 mmol/L使每1 min自氧化速率达0.070，提高了灵敏度、减少了误差。

二、 实验材料及用具

1、实验试剂

植物SOD样品（串叶松香草提取）1g、pH 7.5 质量浓度0.05mol/ L 的磷酸钠缓冲液、丙酮、0.4mmol/L肾上腺素溶液、50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠、双蒸水、100mmol/L盐酸液，内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠

2、实验器具

试管30ml、WFZ UV-2100 型紫外可见分光光度计、501A型超级数显恒温水浴、PHS-3C精密pH计

三、 实验步骤

1、配置溶液：配置pH 7. 5 质量浓度0. 05mol/L的磷酸钠缓冲液、50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液及0.4mmol/L肾上腺素溶液（62:38）；

2、植物SOD样液的制备。将植物SOD样品,加入pH7.5质量浓度0.05mol/L的磷酸钠缓冲液,于4℃条件下3500转/min 离心15min ,取酶液,加入- 20℃预冷丙酮,取沉淀物溶于少量重蒸水中,pH7.5、质量浓度25mmol/L的磷酸钠透析即得酶的粗提液。

3、将配置好的50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液放到30℃±0.5℃水浴中保温20 min；

4、按照下表做实验组合对照组

肾上腺素自氧化法加样表

加样管号	对照组	实验组
50mmol/L pH为10.2的Na2CO3-NaHCO3缓冲液内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠	8.3ml	8.3ml
0.4mmol/L肾上腺素溶液 内含1*10-4M乙二胺四乙酸二钠	0.3ml	/
双蒸水	0.4ml	0.4ml
100mmol/L盐酸液	/	0.3ml
总体积	9ml	9ml

5将配置好的溶液分别放到325nm的分光光度计下测其吸光值，每隔1min记一次吸光值，连续读取14分钟；（试验中保持溶液温度在30oC）

6、绘制时间—OD曲线图，并分析结果。

四、活性测定

肾上腺素法的活力单位定义：30℃时，1ml反应液中每分钟抑制肾上腺素自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。

 酶活性计算公式：

U／mg=(0.070－△A325) ×100%×V总/[0.070×50%·V。·VS]

    其中：

△A325：反应吸光值变化值；

V总：反应总体积(mL)；

VS：加入样品液的体积；

V。：活力单位定义体积（1mL）。