灵长类动物模型在抗艾滋病毒药物研究中的应用

　　摘要:

　　艾滋病（AIDS）灵长类动物模型广泛用于艾滋病毒（HIV）研究。较为常用的有猴免疫缺陷病毒（SIV）/猕猴模型和猴/人免疫缺陷嵌合病毒（SHIV）/猕猴模型,除了在发病机制和抗HIV疫苗研究中的重要作用外,这2种模型在抗HIV药物研究中同样显示出优越性和实用性,体现在药物疗效的研究、新药的开发、耐药性研究、机体免疫反应在药物治疗作用的研究中。通过这些体内抗病毒活性及机制的研究,可进一步揭示药物的抗HIV疗效,对AIDS的临床用药具有重要的指导作用,将使人们重新考虑抗HIV药物的用药原则和药效评价标准。

　　      动物模型是研究许多疾病发病机制、药物和疫苗不可或缺的工具。灵长类动物是人类的近亲，在组织结构、免疫、生理和代谢等方面与人类高度近似，是极其珍贵和重要的实验动物，其应用价值远超过其他种属的动物。自艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)发现以来，科研人员尝试用多种灵长类动物建立合适的动物模型。黑猩猩尽管可以感染人免疫缺陷病毒(艾滋病毒，human immunodeficiency virus，HIV)，但这种动物模型因其来源有限、费用昂贵、不易管理、发病进程慢等原因，限制了其在实际中的应用。非洲的许多灵长类动物自然感染猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)，并且SIV可在体内持续高水平复制，但这些自然宿主不会出现AIDS，因此也不适合用来研究发病机制和评价抗病毒药物和疫苗。SIV强毒株及人工构建的猴／人免疫缺陷嵌合病毒(simian／human immunodeficiency virus，SHIV)感染亚洲猴类，很快会使亚洲猴类发展到AIDS阶段，并且在疾病的发展进程及多个检测指标上与人类AIDS十分类似，所以这种模型被广泛用于AIDS发病机制、抗HIV／AIDS药物和疫苗的研究。

　　1  应用动物模型进行抗HIV药物研究的必要性

　　       目前AIDS在世界广泛流行，截至2005年底，中国现存HIV感染者约65万人。2004年因AIDS死亡的人数约2.5万，每年新感染的患者约有7万。因此，我国应该加强HIV／AIDS预防、诊断及治疗的基础和应用研究。“国家中长期科学和技术发展规划纲要”(2006—2020年)规划的16个重大专项中，就有“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”和“重大新药创制”2个重大专项涉及防治AIDS的药物与疫苗研究，国家将在“十一五”期间进一步加大对HIV／AIDS药物与疫苗研究的支持力度。

　　       由于目前世界上还未研制出有效的抗HIV疫苗，抗病毒药物仍是预防和治疗HIV／AIDS的主要手段。目前大多数抗HIV药物是针对病毒复制周期的主要阶段或主要酶类开发的，如病毒与细胞结合及融合、病毒的逆转录酶(reverse transcriptase，RT)、整合酶(integrase)、蛋白酶(protease)等。美国FDA批准临床上用于治疗HIV感染的28种药物可分为4类：核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTI )、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors，PI )及融合抑制剂。

　　       高效抗逆转录病毒治疗(highly active anti-retroviral therapy，HAART)已经被证实是目前临床上行之有效的抗HIV／AIDS治疗方案，即通常采用3种或3种以上的药物进行联合治疗，这种治疗策略可以最大限度地抑制HIV的复制。但HAART治疗存在费用昂贵、无法清除病毒、毒副作用大、易产生耐药性、药物依从性差等问题，因此迫切需要开发新靶标、高效低毒、价廉的抗HIV／AIDS药物。

　　       新药的开发过程是一个单调、费时及昂贵的过程。体外抗HIV药效学实验与体内实际情况的相关性又存在一定的局限性。多数体外检测有效的化合物，因来源有限、毒副作用大、抗病毒效果差及生物利用度和药动学不理想等原因，无法进入临床试验。在临床试验中，对AIDS患者设安慰剂对照组被认为不符合伦理学，因而严重阻碍了抗HIV新药的开发。因此，很多抗HIV新药的临床试验主要在HAART治疗失败的患者中进行，这些患者通常具较低的CD4＋T淋巴细胞数量、药物依从性差、产生耐药性等，不能完全反映新药的实际疗效。基于以上原因，应用SIV或SHIV感染灵长类动物的AIDS模型来评价抗HIV药物，进行体内药效学研究，对于提示药物的开发前景、指导临床试验具有重要的参考价值。

　　2  抗HIV药物研究的动物种类和病毒株

　　       抗HIV药物研究中主要应用的动物为亚洲猴类，如恒河猴、食蟹猴、平顶猴等。1985年发现了第1个SIV，随后数个SIV病毒株从非洲猴类和亚洲猴类体内分离出来。SIV与HIV-1具有一定的同源性，SIV遗传学上主要分为SIVcpz，SIVsm，SIVmnd，SIVsyk和SIVagm 五大支系。部分SIV病毒株接种亚洲猴如恒河猴、食蟹猴等，会使其感染并很快产生类AIDS症状，其中以SIVmac和SIVsm致病性较强，是抗HIV药物研究中主要应用的病毒株。这些毒株对许多NRTIs(如齐多夫定)、PIS、整合酶抑制剂、CCR5-靶点进入抑制剂等比较敏感，而对NNRTIs(如奈韦拉平、依法韦伦)则不敏感。

　　       20世纪90年代以来，应用分子生物学技术，将HIV-1的一些重要基因与SIV进行重组，相继构建了一系列含有HIV-1和SIV基因的SHIV病毒，并用来感染恒河猴。最初的报告指出，尽管几个SHIV病毒株感染恒河猴，但并不致病。近年研究表明，有数个SHIV病毒株不仅可以感染恒河猴，而且使其产生类似AIDS症状。SHIV基本保持了SIV生物学特性，同时又携带HIV一1部分抗原，它为研究以HIV一1抗原为基础的疫苗和生物治疗等提供了一个较为理想的模型，因此也被广泛用于AIDS研究。以SIV病毒基因组为骨架，用HIV－1逆转录酶基因取代SIV逆转录酶基因构建的具有感染性SHIV(称为RT—SHIV)，对NNRTIs较为敏感，使得RT－SHIV／灵长类动物模型在评价NNRTI上具有重要作用。构建的其他SHIV病毒株(如env－SHIV)因其各自存在的问题，使其在药物评价中的作用受到限制，如SHIV－89．6P，其使用的受体为CXCR-4，感染后CD4+T淋巴细胞快速丢失，这些情况与HIV和SIV感染的典型过程存在差异。

　　3  AIDS灵长类动物模型在抗HIV药物研究中的应用

　　       在AIDS研究初期，灵长类动物模型在抗HIV药物发展中的作用并未受到应有的重视。近年来，随着免疫学和病毒学技术的发展，对发病机制的深入了解和对更有效药物的需求，使AIDS灵长类动物模型在抗HIV药物研究和开发中显示出优越性和实用性，主要作用表现在以下几方面。

　　3.1  预防和治疗HIV感染中的研究

　　       早期研究人员尝试用AZT在灵长类动物模型中进行抗病毒研究，但所表现出的AZT抗病毒效果并不理想。然而，随后对多种包括美国FDA批准上市的和一些新开发的抗HIV药物进行了大量的体内药效学实验和验证，应用灵长类动物模型在药物预防和治疗中取得了2个主要成就：① 发现替诺福韦酯在灵长类动物模型上有较好的抗SIV感染的作用，这一发现成功促进了该药在临床上用于治疗HIV／AIDS患者。Tsai等对SIV感染的恒河猴每隔24 h皮下注射替诺福韦酯，给药开始时间分别为感染前48 h和感染后4，24 h，药物治疗共持续4周，同时对动物体内病毒和机体免疫反应进行了56周的监测。结果发现，无论在感染前治疗和感染后给药，替诺福韦酯均可有效抑制病毒的复制。这一实验的成功引起了人们对替诺福韦酯的兴趣，极大地促进了对它进一步研究。随后大量的动物实验证明，对病毒的不同接种途径(静脉、口腔、阴道、直肠)，替诺福韦酯均有较好的抗病毒效果。Van Rompay等用替诺福韦酯治疗口服接种SIV的新生猴，结果发现，直至19～23个月龄时，9只接种病毒的新生猴中的6只获得了有效保护，提示替诺福韦酯对治疗新生儿AIDS和阻断病毒通过哺乳的母婴传播具有一定疗效。临床应用结果也表明，替诺福韦酯有较好的抗HIV作用。在小规模的Ⅱ期单药研究中，替诺福韦酯使10例患者的HIV病毒载量在21 d内平均下降了1.5 log，在降低病毒载量方面的疗效可以与利托那韦的单药治疗相媲美。② 确立了D4T在暴露后紧急预防治疗(immediate post—exposure prophylaxis，PEP)中的作用。之前广泛认为，AZT单药方案可用于预防人暴露后感染，但随后报道，有多例仅采用AZT单药方案预防性治疗失败，提示单一药物预防性治疗并不能完全阻断HIV的感染。同时，还有报道PEP治疗太晚也会导致治疗失败。动物模型实验结果表明，暴露后尽早进行短期高强度治疗可有效阻止病毒感染。Watson等采用CD4+T对HIV-2感染的平顶猴(pig-tailed monkey，Macaca nemestrina)进行治疗，发现在感染后尽早进行药物干预，可有效抑制CD4+T淋巴细胞下降，控制血浆中病毒载量，从而明确了D4T在PEP中的应用，同时提示了尽早进行药物干预对PEP治疗的重要性。目前，美国CDC推荐实施PEP越早越好，主张暴露后72 h内进行二联或三联抗HIV药物治疗，疗程28d。

　　3.2  耐药性研究 

　　       耐药性是AIDS治疗中一个棘手的问题，严重影响药物疗效。体外实验表明耐药病毒株与原始病毒株相比，在毒力和复制能力上发生了变化，其对抗病毒药物敏感性下降。耐药病毒株复制能力的变化，可在早期HIV耐药株感染的患者中进行研究。耐药病毒返祖情况可在间歇性药物治疗的患者中进行。但由于受到实际诸多因素的限制，这些研究很难达到预定目标。如果耐药导致病毒毒力降低，持续进行药物治疗是否可抑制强毒性的原始毒株的复制，这些也无法用体外实验来证实，需进行体内实验研究。灵长类动物模型提供了该项研究的可能，将耐药病毒株或原始病毒株接种动物，设药物处理组和非处理组，然后检测病毒的毒力、复制能力和细胞嗜性等。

　　       根据已知的HIV耐药病毒株基因突变位点，通过分子克隆定点突变技术获得耐药性SIV或SHIV变异株，接种动物后进行药物治疗，直接从动物体内获得耐药性SIV或SHIV变异株，从而研究HIV耐药性产生的机制。AZT处理SIVmac251感染的恒河猴，结果检测到病毒逆转录酶151位的谷氨酸突变为蛋氨酸(Q151M)，该变异株体外对AZT具有耐药性。将Q151M突变SIVmac251接种新生猴，病毒的复制力和毒力并未发生明显降低 。Q151M 突变还未在AZT治疗的HIV一1感染的患者中发现，但在接受NRTI治疗的HIV一2感染的患者中发现了这一突变，表明针对AZT耐药性突变，SIV与HIV－2具有相似的突变途径，而与HIV－1有一定差异性。替诺福韦酯长期治疗SlVmac251感染恒河猴，病毒RT第65位的赖氨酸突变为精氨酸(K65R)。在替诺福韦酯治疗的HIV一1感染患者中也发现该突变的出现。3TC或emtricitabine[(－)－FTC]治疗SIV感染幼猴5周后，RT的184位氨基酸发生了突变(M184V)。将SIVmac239和SIVmac239 M184V分别接种青年恒河猴，接种1周后(未用药物治疗)检测病毒，发现SIVmac239．M184V复制力降低，接种2周后[用(一)一FTC治疗]，原始株与变异株感染动物血浆病毒载量、疾病进程等无明显差异，说明M184V变异对病毒毒力未产生影响。这些实验结果表明应用灵长类动物模型进行耐药性研究的可行性，同时也表明体外试验结果与体内试验结果具有较大的差异性，体内试验更能表明耐药株在毒力、复制能力和细胞嗜性等方面的真实情况，以便制定合理的药物治疗方案。

　　3.3  药物治疗中机体抗病毒免疫反应的研究

　　       药物治疗与机体免疫反应之间相互关系及其机制是近年药物治疗中研究的热点。AIDS动物模型研究结果表明，在药物治疗中机体抗病毒免疫反应起着十分重要的作用。对病毒复制的控制，不仅取决于药物疗效，还在于机体免疫系统状态。药物抗病毒最佳疗效的发挥，需要在机体免疫反应的协助下完成，尤其是细胞免疫起着十分重要的作用。经体内清除CD8＋ T淋巴细胞，建立CDs T淋巴细胞缺陷的AIDS猴动物模型，进行抗AIDS药物疗效研究，证实，CDs T淋巴细胞在药物治疗中具有重要作用。用替诺福韦酯对SlVmac251感染的恒河猴进行早期药物处理，发现药物治疗不能有效控制CDs T淋巴细胞缺陷动物体内的病毒复制，而对照动物体内病毒的复制得到了有效控制，病毒载量维持在较低水平。该实验证实CD8 T淋巴细胞调节的抗病毒免疫反应，对抗病毒药物疗效的发挥具有重要的协同作用，其原因可能是CDs T淋巴细胞通过细胞毒或非细胞毒作用杀灭病毒感染的细胞，从而降低病毒粒子的产生，而缺失cDT淋巴细胞后，感染病毒细胞有较长的半衰期，可以产生大量的病毒粒子。抗HIV药物对患者机体免疫重建是今后药物治疗和新药开发的重要方向之一，但大多试验研究都无法直接进行临床试验，而AIDS灵长类动物模型将在这方面发挥越来越重要的作用。

　　4 灵长类动物模型在抗HIV药物研究中存在的问题

　　       目前广泛使用的几种AIDS灵长类动物模型面临的最主要问题在于不能完全模拟临床上HIV感染的情况以及不同的灵长类动物感染不同的免疫缺陷病毒后，其免疫反应、病毒载量、临床症状及发病情况都存在较大差异。例如恒河猴感染SlVmac251后具有较高的病毒血症，较低的抗病毒特异性免疫反应，发病进程较快。非洲绿猴感染SIVagm后，虽然会出现较高的病毒血症，但动物仍然会保持健康状态。相同的灵长类动物感染同一种免疫缺陷病毒，疾病进程也会出现较大的个体差异性，无症状期可持续数月到几年。所以如何建立一个感染特性稳定的动物模型体系，以便降低药物治疗中因宿主因素引起的差异，是目前亟待解决的问题。此外，SIV或SHIV与HIV对药物敏感性差异也是灵长类动物模型在抗HIV药物研究中面临的问题。尽管很多SIV对多数抗HIV药物比较敏感，但体内外研究结果表明，一些具有较好抗HIV效果的药物，对于SIV的抗病毒效果并不理想，如AZT是最早批准使用的NRTIs，至今也是临床上最常用的治疗HIV药物之一，然而却不能有效控制SIV的感染。

　　5 结语

　　        AIDS灵长类动物模型已经成为进行HIV相关研究的一个有力工具，在抗HIV药物临床前药效学研究中，这一模型提供了最接近药物实际疗效的参考系统。同时，最佳治疗方案和治疗策略的制定和检测，有时很难在临床上进行，更无法通过体外实验进行，而应用灵长类动物模型进行相关研究已成为目前的首选。药物体内抗病毒机制及机体免疫反应与药物疗效相互关系研究是近几年药物研究中的重要方向之一，合适的灵长类动物模型体系为这些研究的深入提供了有力保障，可系统地进行免疫重建和药物疗效检测并深入进行相关机制研究。从20世纪90年代初期开始，中国医学科学院实验动物研究所、广州中医药大学热带医学研究所、中国科学院昆明动物研究所和武汉大学等单位相继在国内建立了SIVmac251，SIVmac239和SHIV感染猕猴的AIDS灵长类动物模型，开展了AIDS发病机制、药物和疫苗的评价研究工作，取得了一些进展。国家食品药品监督管理局在发布的“抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则”中明确提出：体内药效学研究对于进一步说明药物的抗病毒作用、指导临床试验有重要的参考价值。但是，这种模型在抗HIV药物评价中也存在一定缺陷：SIV或SHIV与HIV对药物具有不同的敏感性，因而不能准确鉴定药物对

　　HIV的抗病毒作用；不同的灵长类动物对SIV或SHIV的感染特性也不尽相同，这也影响药物抗病毒疗效的评价。但通过谨慎设计研究方案，这一模型还是可以提供更多有价值的参考，更好地指导未来临床试验研究。

　　      [1].文      题： 恒河猴Mamu-A~*01基因与SIV/SHIV感染相关的研究进展

　　    作者及单位：刘秀英,丛喆  中国医学科学院北京协和医院实验动物研究所

　　[2].文      题： 灵长类动物模型在抗艾滋病毒药物研究中的应用

　　    作者及单位：李明华,张高红  中国科学院昆明动物研究所动物模型与人类疾病机理重点实验室分子免疫药理学实验室

　　[3].文      题： 抗HIV药物的筛选评价方法

　　  作者及单位：苗文泉,李敬云  军事医学科学院微生物流行病研究

　　[4].文      题： HIV/艾滋病疫苗:策略及展望

　　  作者及单位：杨春红,宋长征  山东省交通医院

　　[5].文      题： HIV-1感染恒河猴外周血单个核细胞的生物学特性和C2-V3区基因序列变化

　　  作者及单位：马丽英,邢辉  中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心

　　[6].文      题： 人类艾滋病动物模型研究进展

　　    作者及单位：杨传波,徐兴然  西南农业大学动物科技学院

　　[7].文      题： 人类AIDS的研究替身--非人灵长类动物模型

　　    作者及单位：李明华,何昭阳  中国科学院昆明动物研究所

　　[8].文      题： 应用鼠白血病病毒L6565建立小鼠艾滋病模型

　　   作者及单位：贾敏,杨铁虹  第四军医大学药理学教研室