技术领域
[03]本发明涉及微生物产品领域。特别地，它涉及对于各种工业用途具有改良性 质的微生物产品。
背景技术
[04]黄原胶（xanthan)的化学结构由具有三糖侧链的线形纤维质(1—4)-P-D-葡萄 糖聚合物组成，所述三糖侧链由甘露糖、葡萄糖醛酸和甘露糖组成，它们交替地 结合到骨架中的葡萄糖残基上。（Milas and Rinaudo， Carbohydrate Research, 76,189-196, 1979)。因此，黄原胶可以描述为具有五糖重复单元的带支链的聚合物； 通常的黄原胶一般具有2000-3000个五糖重复单元。黄原胶聚合物通常通过对甘露 糖残基进行乙酰化作用和丙酮基化作用（pyruvylation)而被修饰。
[05]通过黄单胞菌属（^/"/ZK^o"oy)细菌的作用，由碳水化合物发酵产生生物合 成的水溶性多糖黄原胶是公知的。最早的工作是由美国农业部开展的，并描述于 美国专利3,000，790中。黄单胞菌属亲水性胶体（"黄原胶"）是胞外杂多糖。
[06]黄原胶由黄单胞菌属的细菌通过需氧深层发酵（aerobic submerged fermentation)产生。发酵培养基通常含有碳水化合物（诸如糖）、微量元素和其他 营养物。发酵完成后，通常对所得到的发酵肉汤（溶液）加热处理。众所周知， 在转变温度（Tm)或转变温度以上对黄原胶发酵肉汤和溶液进行热处理，导致天 然黄原胶的构象发生变化，产生高粘度的黄原胶。热处理也具有破坏黄原胶中存 活的微生物和不想要的酶活性的有益效果。热处理之后，利用乙醇沉淀回收黄原 胶。然而，对黄原胶发酵肉汤进行热处理也有其不利之处，诸如引起黄原胶的热
降解。将黄原胶溶液或肉汤加热至超过TM,或将它们保持在TM之上的温度若干秒
时间以上，会导致黄原胶发生热降解。黄原胶的热降解不可挽回地降低它的粘度。因此，热处理是控制黄原胶的质量或稠度的重要技术。
[07]黄原胶的质量主要通过两种粘度测试来测定：低剪切率粘度（Low Shear Rate Viscosity) ("LSRV"),这在自来水溶液中进行的；和海水粘度（Sea Water Viscosity) ("SWV")，这在高盐水溶液中进行。已经发现，对黄原胶发酵肉汤在TM温度或高 于TM温度下进行巴氏消毒产生更高粘度的黄原胶，这通过更高的LSRV和SWV值显 示出。
[08]黄原胶聚合物用于许多场合中。黄原胶有广泛的工业应用，包括用在油井钻 探泥浆（oil well drilling muds)中，其作为通过注水二次回收石油时的粘度控制添 加剂，它还用作食品增稠剂，用作稳定剂，用作乳化剂、悬浮剂和胶黏剂 (Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, 2nd Edition, Editors John Wiley & Sons, 901-918， 1989)。黄原胶也可以用于化妆品制剂、药物载体（pharmaceutical vehicles)和类似的组合物。
[09]在本领域中需要产生在未经巴氏消毒的状态中具有更高的比粘度特性的黄原 胶聚合物。例如在食品、工业和油田应用中，此种具有更高的比粘度的黄原胶聚 合物在等同的黄原胶浓度下可以提供更多的粘度。
发明概述
[10]在第一种实施方案中，提供了未经巴氏消毒的黄原胶组合物。该组合物可以 由过量表达^w^和gwwC的细胞产生。它的特性粘度（intrinsicviscosity)比由不过 量表达^w5和wwC的相应菌株产生的黄原胶高至少20 %。
[11]在第二种实施方案中，提供了黄原胶组合物。它包含一群（population)分子， 其具有各种分子长度。该群中至少iy。的黄原胶的长度大于3^im，这由原子力显微 术测定得到。
[12]在本发明的第三种实施方案中，提供了生产黄原胶聚合物制剂的方法，与由 野生型菌株产生的黄原胶聚合物制剂相比，该制剂具有增加的粘度。在野油菜黄 单胞菌（Z""Aowomyc"wj^y加;y)培养物中，gwn万和gwwC基因产物的数量选择性 地增加。or/②因产物的数量未被选择性地增加。选自gwmD-^wG的基因产物的 数量也未选择性地增加。更高粘度的黄原胶聚合物制剂由此由培养物产生。
[13]在本发明的第四种实施方案中，提供了生产黄原胶聚合物制剂的方法，与由 野生型菌株产生的黄原胶聚合物制剂相比，该制剂具有增加的粘度。野油菜黄单 胞菌菌株在其可产生黄原胶聚合物的条件下，被培养在培养基中。相比起野生型 菌株，该菌株选择性地产生更多的g"m5和gwmC基因产物，而orjX或选自gwwZ)-gwwG的基因的基因产物没有被选择性地增加。
[14]在本发明的第五种实施方案中，提供了未经巴氏消毒的黄原胶组合物。该组 合物由过量表达^/m万和^mC的细胞产生。该组合物的海水粘度比由不过量表达
gMw5和gM/KC的相应菌株产生的黄原胶高至少10 %。
[15]因此，本发明为本领域提供了黄原胶组合物，其相比起由相应野生型菌株类 似地产生的黄原胶组合物，具有增加的粘度。
附图简述
[16]图l示出了涉及gww5-M操纵子的遗传图谱的遗传结构，gwn5-M操纵子也称为 x;^B-ikf (黄原胶多糖合成）操纵子。
[17]图2A和2B分别示出了gw;w5和gw/wC蛋白质产物表达的蛋白质印迹分析。
[18]图3示出了黄原胶样品的特性粘度（intrinsicviscosity)图，因存在携带有过量 拷贝的基因的质粒的缘故，其中一个样品过量表达^m^和gwwC基因产物。
发明详述
[19]本发明的发现是，相比起它们的操纵子中的其他基因，gwmS和gwwC基因产物 的过量表达，产生具有更高粘度的黄原胶产物，基于重量单位来计算（on a per weightbasis)。尽管申请人不希望受到任何特定的操作理论的限制，似乎是某些基 因产物的比率的变化，导致黄原胶聚合物分子的尺寸分布的变化。相当数量的分 子的分子长度比由野生型细胞产生的黄原胶更长。这些更长的分子产生更高粘度 的群体或制剂。
[20]在本领域中已知，粘度的增加可以通过对黄原胶制剂进行巴氏消毒而实现。 参见Talashek等的美国专利6,391，596。然而，观察到，即使不进行巴氏消毒，gww5 和gi^C的过量表达也能够导致粘度的增加。尽管如此，随后对本发明的产物进行 巴氏消毒，将产生更具粘性的制剂。
[21]看来，gjm^和^mC的过量表达是实现增加的粘度所必需的。当对任一基因单 独测试时，则未观察到粘度增加。通过与gw^-M操纵子中的其他基因相比较，可 以评价gz/m5^7gMwC的过量表达。尽管相对于那些基因中的任何一个的过量表达都 可足以取得该效果，但相对于or，^mD的过量表达是特别显著的。0/^T是之前 作为该基因组的片段公布的小型开放阅读框，命名为g"wj，就在gww5的上游。最 近在先前的gz/wj区域发现了两个开放阅读框，//?/和o/^。相对于g^D-gwmM中的 所有基因的过量表达可以被期望。[22]通过本领域任何已知的方法，可以实现所期望的基因产物的过量表达，方法
包括但不限于：将编码期望的基因产物的基因的更多拷贝导入野油菜黄单胞菌细 胞或产生黄原胶的其他细菌中，和使用如诱导型启动子来诱导期望的基因产物。 产生黄原胶的其他细菌包括那些已经经过遗传工程处理而含有黄原胶生物合成基 因的细菌。gW^和g腿C基因可以被导入一个或多个载体，即它们是联合的或单独 的。
[23]根据本发明，可以使用的诱导型启动子包括本领域任何已知的启动子，包括 fec启动子、ara启动子启动子、"?启动子和/ac启动子。用于这些启动子的天然和人 造诱导剂是本领域已知的，且可以方便地使用。例如，额外拷贝数的基因可以被 导入到质粒或病毒载体上。被期望的基因的额外拷贝可以保持在染色体外，或可 以整合入基因组中。
[24]从培养肉汤中回收黄原胶通常涉及一个或多个操作步骤。黄原胶可以进行热 处理。黄原胶可以用醇沉淀，诸如异丙醇、乙醇或丙醇沉淀。通常，细胞不特别 地从培养肉汤中除去。
[25]生物合成产生的黄原胶分子通常具有尺寸分布。通过增加长度比平均长度长 得多的分子的数量，或通过将长度比平均长度长一些的分子的数量增加到更大的 程度，可以实现本发明的粘度增加。具有增加的长度的分子的数量不必是极为巨 大的。至少1%、 3%、 5%、 7%、 9%或11 %的分子具有增加的长度，可以是足够的。 长度增加的分子可以大于3、 4、 5、 6、 7、 8或9pm，这用原子力显微术测定。长度 大于3、 4、 5、 6、 7、 8或9pm的分子对整个黄原胶群体的质量所贡献的百分比，大 于它们在群中的数量比例。因此，黄原胶分子总质量的至少1%、 3%、 5%、 10%、 15%、 20%或25%,由长度大于3pm的分子构成。
[26]特性粘度测定是表征本发明的制剂的另一种方法。使用这种测定方法，观察 到的特性粘度相比起由野生型菌株产生的要增加5%、 10%、 15%、 20%、 25%、 30% 或35%。用于比较目的的合适的对照是那些与正被测试的菌株最为相关的对应菌 株。因此，如果测试菌株具有过量拷贝的gww5和gwwC，最好的对照将具有同样的 遗传组成，但不存在过量拷贝的^祝5和^/;wC。如果测试培养物已由诱导剂诱导以 产生更多的gwm万和gw附C基因产物，那么最好的对照将是未被诱导的同样的菌株的 培养物。海水粘度也可以被用于表征本发明的制剂。使用这种类型的测定，观察 到的粘度比由野生型菌株产生的要增加达5%、 10%、 15%、 20%、 25%、 30%或35 %。
[27]黄原胶作为组成成分而被用于许多产品中，以改善产品特性。举例来说，特 性可以包括粘度、颗粒悬浮性、口感、大小。其他的特性包括水结合性(water-binding)、增稠性、乳剂稳定性、增泡性和剪切弱化。此类产品包括食品、 诸如色拉调味剂、糖浆、果汁饮料和冷冻甜点。此类产品也包括印刷染料、石油 钻井液、陶瓷釉和药物组合物。在后一种情况中，黄原胶可以用作载体和受控释 放（controlled release)基质。其他可以使用黄原胶的产品包括，清洗液、油漆和 墨水、墙纸粘合剂、杀虫剂、牙膏以及酶和细胞固定剂。
[28]尽管本发明通过具体的实施例一包括目前实施本发明的优选方式一来描述， 但本领域技术人员将认识到，对上述系统和技术可以有大量的变化和置换，它们 落入权利要求书所描述的发明精神和范围内。
实施例
实施例l一菌株构建
[29]为了分离出携带野油菜黄单胞菌的完整gwm基因区域的片段，野油菜黄单胞菌 野生型菌株，NRRLB-1459 (1)的基因组文库，用广宿主范围的柯斯质粒载体 pRK311 (2)构建，其通过克隆用Sfl"3AI部分消化的总DNA来实现。该文库整个 地由大肠杆菌^7-/ (3)交配到Gum'野油菜黄单胞菌突变株2895 (4)。从若干粘 液样接合后体分离出的柯斯质粒中的一个，称为pIZD15-261 (5),含有包括了整 个gmw区域的16kb片段。参见图l的图解说明和表l的操纵子基因列表。
表l
<table>table see original document page 11</column></row> <table><table>table see original document page 12</column></row> <table>
*基因位置依据野油菜黄单胞菌野油菜变种（Z c"w/^/r^ /jv.caw/^/n;?) ATCC33913 (GenBank保存：AE008922)的基因组序列，如da Silva, A. C. R., et al.: (Nature, Vol. 417, pg. 459-463,2002)描述。
〖30]为了构建pBBR5-BC质粒，用S戸I-Sg/II对pIZD15-261进行消化，将所得的4026 bp的片段克隆在pKmob19 (8)的;》"1和^^//1位点之间，产生pGum02-I9S (5)。 用S;jW对质粒pGum02-19S进行消化，得到2855 bp的片段。将该片段克隆入pUC18 (9)，其之前用&W消化，形成pUC18-BCAS。
[31]通过将含有giwi启动子以及gimiJ5和gMwC基因的历"dlII-Z&fll片段克隆入用 历"dni-^Z^I消化的pBBRl-MCS5 (10) (GenBank编号U25061 )，构建得到最终质 粒（pBBR5-BC)。
[32]所得到的pBBR5-BC质粒的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:l中。（对gwmS和 gwwC预测的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:2和3中）。该广宿主范围的、中等 拷贝数的质粒为7.6 kb长，并与IncP、 IncQ和IncW组的质粒以及基于ColEl和P15a 的复制子相容。当RK2转移功能以反式方式（in /raw)提供时，转移起始点 (wo&RK2)的存在使得它能够通过与广范围的细菌接合而发生转移。它也携带庆 大霉素抗性基因，且它含有位于编码LacZ a肽的基因内的pBluescript II KS多克隆 位点（pBluescript IIKS ，来自Stratagene, La Jolla, Ca， USA)。
[33]为了确证来自pBBR5-BC的GumB和GumC蛋白质的表达，将质粒导入野油菜 黄单胞菌突变株1231，野油菜黄单胞菌突变株1231中的整个^wm(x;^)基因簇被剔除 掉。两种蛋白质在突变菌株中用蛋白质印迹法检测到。表2.在本工作中使用或构建的细菌菌株和质粒
<table>table see original document page 13</column></row> <table>杆菌菌株于37'C,培养于Luria-Bertani培养基中。野油菜黄单胞菌菌株于28T:,培 养于TY (每升H;jO，含5g胰蛋白胨、3g酵母提取物，和0.7g CaCl2)或YM培养基 中（12)。依需要补充Sigma (St. Louis, Mo.)的抗生素，浓度如下（按每毫升微克
数计算）：对于野油菜黄单胞菌，庆大霉素30;和四环素10;对于大肠杆菌，庆大 霉素10;卡那霉素30;氨苄青霉素100;和四环素IO。
[35]DNA生物化学。使用QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Hilden, Germany), 制备来自大肠杆菌和野油菜黄单胞菌的质粒DNA。 DNA限制性内切、琼脂糖凝胶 电泳和克隆程序，根据已有的方法（13)实施。所有结构由DNA测序确认。利用 Bio-Rad (Richmond, Calif.)(所使用的参数：大肠杆菌：200Q、 25^F、 2500V和野 油菜黄单胞菌：IOOOQ、 25^iF、 2500V)教导的电穿孔法，将质粒DNA导入大肠杆 菌和野油菜黄单胞菌细胞中。
[36]核苷酸和蛋白质序列分析。使用MacVector Sequence Analysis Software (Oxford Molecular Limited, Cambridge, UK),对核苷酸和氨基酸序列进行分析。
实施例2""gww5和gwwC表达的蛋白质印迹分析
[37]蛋白质印迹分析证实，gMw5和gwwC基因产物在携带额外拷贝的gww5和g函C 的野油菜黄单胞菌菌株中是被过量表达的。参见图2。
实施例3—特性粘度测定
[38]将由携带（XWCMl/pBBR5BC)或不携带（XWCM1)多个gwm5和gw附C基 因的质粒编码拷贝的野油菜黄单胞菌菌株制备的黄原胶样品进行比较。使用葡萄 糖作为碳源，进行摇瓶发酵，从这些菌株获得黄原胶。
[39]通过测量纯化的和未纯化的黄原胶样品的粘度，确定特性粘度。观察到，具 有多拷贝^附^和g"加C的野油菜黄单胞菌菌株产生的黄原胶的特性粘度增加。当在 相同的溶剂和温度条件下测量时，特性粘度与给定的聚合物类型的分子量成正比。 因此，相比起来自对照菌株的黄原胶，具有多拷贝的gtw^和gwwC的野油菜黄单胞 菌菌株产生的黄原胶具有更高的分子量。
[40]方法：对于这两种肉汤中的每一种，均有5个摇瓶被测量。将每一种类型的肉 汤合在一起，测定总体积。然后将肉汤在异丙醇中沉淀。（注意：估计培养液含有 约3%的胶。测量总肉汤体积，并乘以3%，得到近似的千胶重量。该近似值用于计 算产生大约0.5%胶溶液所需要的水量）。湿的纤维沉淀物然后立即混合在0.01M NaCl中，再次进行水合，以产生近似0.5%的胶溶液。通过使用3叶的2英寸直径螺 旋桨搅拌器，以良好的剪切，将该纤维混合3小时，然后，使其保持过夜。下面的步骤用于制备样品，该样品用于特性粘度测定。
[41]使用GehnanScience293mm加压过虑装置，过滤上面制备的〜0.5%的胶溶液。 该溶液首先过滤通过20n Magna尼龙过滤器（N22SP29325)。将过滤器加压到〜60 psi，将溶液收集于干净的烧杯中。（注意：当流速降低到每分钟〜5滴时，更换过 滤器）。
[42]第一次过滤步骤之后，使用上面的过滤装置将样品再过滤两次。首先，通过 Millipore 8.0p过滤器（SCWP293 25)，然后通过Gelman Versapor® 293 mm 1.2p过 滤器（66397)。每一过滤步骤之后，将过滤的样品回收在干净的烧杯中。
[43]过滤之后，将〜600ml的胶溶液置于Spectra/Por(g)透析管，28.6mm直径Spectrum 弁S732706 (MWCO 12,000至14,000)。将管切割成〜18-20英寸的长度，并在一端 打结。将溶液加入到管中，将其充满至距离端部的2英寸内。将管打第二个结，这 样，尽可能少的空气留于管中。继续直到所有的胶溶液都置于透析管中。
[44]用去离子水冲洗含有胶溶液的管的外部约l分钟，然后，将管置于含0.01M NaCl的容器中。盐溶液应该全部覆盖透析管。
[45]将管保持在0,01M NaCl溶液中4天，每天更换NaCl溶液。4天后，切开管的一 端，并小心地将胶溶液转移到干净的烧杯中。
[46]使用下述程序，计算过滤透析溶液中的固体：
[47]使用能够称量i0.0002g的分析天平，称量并记录干净的铝称重盘VWR Cat弁 25433-008的重量。（A)
[48]使用干净的移液管，将近似10ml的胶溶液加到铝盘上，并记录盘和胶溶液的 精确的总重量。（B)
[49]将盘连同溶液置于105'C干燥炉中，并保持24小时。
[50]24小时后，将盘从炉中拿出，冷却并重新称重。记录下盘和剩余干胶的总重量 (C)。
[51]将铝盘和胶溶液的重量(B)减去铝盘的重量(A)。将干胶和盘的重量(C)减去铝 盘的重量(A)。将第一个值(B-A)除以第二个值(C-A)。并将该值乘以IOO，得到％固 体。
[52]注意：使用上述程序，对每一过滤透析溶液中固体的计算分三次重复进行。然 后将每一样品的计算得到的％固体进行平均，并使用所得到的平均值。[53]基于对每一溶液的固体的测定，使用0.01MNaCI将样品稀释至0.25o/。的总胶浓度。
[54]特性粘度测定通过使用Vilastic Viscoelasticity Analyzer (Vilastic Scientific, Inc., Austin, TX，配置有半径0.0537 cm、长度6.137cm的管）来进行。该仪器在进行测 定之前用水校准，并在测定完成之后进行校验。使用该仪器的TIMET软件实验方 案进行测定，设置频率为2.0Hz,恒应变为l.O，积分时间（integration time)为10秒。 温度维持在23.5'C。通过稀释0.25%的胶溶液，制备样品。将每一稀释液混合20分 钟，并在测定之前将其冷藏过夜。将每一稀释液进行6次测定，并算出平均值。下 表3示出了稀释过程和每一制备得到的样品所测得的平均粘度。
表3<table>table see original document page 16</column></row> <table>
[55〗根据71sp = ((Tlc—T]。） /!!。)，其中T^胶溶液的粘度，将比浓粘度（Tlsp/C)对胶浓 度作图，测定特性粘度。截距为特性粘度。参见图3。
[56]相信,XWCMl/pBBR5-BC变体的特性粘度的增加，是由于分子量增加的缘故。 当在与该实验进行时相同的溶剂和温度条件下测量时，特性粘度与给定的聚合物 类型的分子量成正比。[Ti]和分子量之间的关系由Mark-Houwink方程式h] = AMa给 出，其中，k和a在特定的溶剂中和特定的温度下，对于特定的聚合物类型是恒定 的。因为常数"a"是正数，只有分子量（M)增加时，h]才增加，除非样品具有 不同的分子构型，在这时，Mark-Houwink方程不适用。
实施例4一程序一低剪切率粘度测定
[57]低剪切率粘度测定以纯化的黄原胶为对象来实施。用于测定LSRV的程序在下 面有详细描述。观察到，相比起由对照菌株产生的黄原胶，由具有多拷贝的g"w万 和^/wC的菌株产生的黄原胶的粘度增加。数据显示，gw/nB和gwwC的过量表达是 链长度的增加所需要的；gwm5或者^wC的单独过量表达不足以增加链长度。[58]材料和设备-
1. 标准（合成）自来水（含有1000 ppm NaCl和40 ppm Ca—或147 ppm CaCl2«2H20的水）：通过将20 gm的试剂级NaCl和2.94 gm的试剂级 CaCl2*2H20溶解于合适容器中的20升蒸馏水中来制备。
2. 能够精确测量至0.01gm的天平。
3. Brookfield LV粘度计，心轴# 1和心轴保护装置。
4. 标准实验室玻璃器皿。
5. 标准实验室搅拌台（stirring bench)。 RAE搅拌动力器（stirring motor)
(C25U)和搅拌轴（stirring shaft) (5/16，，），带有3叶螺旋桨，可以 被替换。
[59]程序：
1. 用600ml Berzelius (高式）量杯称量299ml的合成自来水，向其中缓 慢加入0.75 gm (称量至最接近的O.Olgm)的产物，同时以800rpm的
转速搅拌。
2. 在800rpm搅拌4小时后，将溶液从搅拌台移去，使之保持30分钟。
3. 将温度调节到室温，并使用Brookfield LV粘度计，1弁心轴在3 rpm转 速时测量粘度。在将心轴旋转3分钟之后，记录粘度。
实施例5—蛋白质表达的定量
[60]将细胞裂解物进行蛋白质印迹和免疫检测分析，以确定质粒编码的gumB和 gumC的水平。四次独立的印迹被分析。尽管在每一次定量分析中，同一样品的绝 对值不能被重复，但是在所有测定中，样品之间的相对数量保持相同。
[61]针对GumB和GumC产生的抗体的制备。利用PCR扩增，产生编码GumC蛋白 氨基酸残基53-447的、长为1184bp的DNA片段。使用下述引物：F2135: 5'GGAATTCCATATGTTGATGCCCGAGAAGTAC-3， （SEQ ID NO:4)和B3319: 5'CGGGATCCTCAAAAGATCAGGCCCAACGCGAGG-3， （SEQIDNO:5)。 PCR产 物用MM和AtwHI消化，并亚克隆入pET22b (+)，将所得到的质粒（pET-C)导入 大肠杆菌菌株BL21 (DE3)。
[62]将大肠杆菌BL21(pET-C)培养在含5(Hig羧苄青霉素/ml的L-培养液中，培养至 OD6oo为0.6，然后用l mM IPTG诱导3小时。通过在37'C,用裂解缓冲液（50mM Tris/HClpH8' 1mMEDTApH8' 100mMNaCl， lmMPMSF, O.lmg DNase m1-1， 0.5% Triton X-100)中的lmg/ml的溶菌酶处理30分钟，再在冰上超声处理，制备总 细胞裂解物。通过低速离心（Eppendof, 4000xg， 5分钟），去除细胞碎片，通过 在14000xg离心i0分钟，上清液被分离为可溶组分和沉淀（包涵体）组分。沉淀组分用裂解缓冲液洗涤2次，所用裂解缓冲液的体积与原细胞裂解物的体积相同，用 含2mg/ml的DOC的裂解缓冲液洗涤l次，然后用水洗涤3次。处理完之后，蛋白质 用SDS-PAGE分离，切下含有过量产生的GumC蛋白质的主要条带，并洗涤以用于 对兔子进行免疫。
[63]将大肠杆菌JM109(pQE-Xps井6， pREP4)培养在含50pg/ml羧苄青霉素和 25nig/ral卡那霉素的L-培养液中，培养至OD6oo为0.6，然后用lmM IPTG诱导3小时。 通过在37。C，用裂解缓冲液（50mMTris/HClpH8， lmMEDTApH8， lOOmMNaCl， lmMPMSF， O.lmgDNasemr1， 0.5% Triton X-100)中的Img/ml的溶菌酶处理30 分钟，再在冰上超声处理，制备总细胞裂解物。通过低速离心（Eppendof， 4000xg， 5分钟），去除细胞碎片，通过在14000xg离心10分钟，上清液被分离为可溶组分和 沉淀（包涵体）组分。沉淀组分用裂解缓冲液洗涤2次，并重新悬浮于含6M盐酸胍 的100mM磷酸缓冲液(pH7), 5mM DTT, 5mM EDTA中，包涵体在用缓冲液D (4M GdnHCl， 50mM磷酸缓冲液(pH7)， 150mM NaCl)进行预平衡的FPLC Superdex HR200 (Pharmacia Biotech)上进行色谱分析，收集含有GumB的级分并用于免疫 小鼠。
[64]质粒pFD5、 pBBR-promC和pBBR5陽B的构建。通过用万awffl ( #318和# 3459) 部分消化pIZDl5-261,获得含有gw/n5和gwmC基因的3141 bp的片段，并将其克隆 入5awHI消化的pRK404，产生质粒pFD5。通过用五coRI (#1979)和5awHI (# 3459)消化pGum02-19，分离出1480bp的片段，并将其克隆入之前用同样的酶消化 的pBBRlMCS-5中，产生pBBR-promC。用MCS中的历"dIII和五coRI (#1979)消 化pGum02-19，产生1233bp的片段，将其克隆入pBBRlMCS-5，产生质粒pBBR5-B。
[65]用上面制备的GumC来免疫新西兰白雌兔。初次给兔注射500ng蛋白质和弗氏 完全佐剂（complete Freund's adjuvant),然后每隔一周注射250吗的蛋白质和不完 全佐剂，共3次。用上面制备的GumB来免疫BALB/c雌鼠。初次给小鼠注射100ng 蛋白质和弗氏完全佐剂，然后每周一次注射50吗的蛋白质和不完全佐剂，共3次。 按照Harlow & Lane ((1999) C/y/"g赠》oW饥'a /cr60raf017柳""a/, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)中描述的方法制备多克隆抗体， 并将抗血清保存在-70。C。为了获得GumC特异性抗体，血清用大肠杆菌BL21 (pET22b+)和Xcl231丙酮粉来吸附（Harlow & Lane， ra/?ra)。
[66]蛋白质提取物。通过电穿孔法将质粒导入亲代菌株PRM-1。将所得的菌株在 28°C，培养在YM培养基中，250rpm振荡培养至对数中期。离心收集细胞，并测定 湿重。用10mMTris/HCl， 10mM EDTA(pH 8.0)洗涤沉淀两次，以去除外多糖，并 以100mg/ml的浓度重新悬浮于同样的缓冲液中。将1 OOpl缓冲液A (1 OmM Tris/HCl， 10mM EDTA (pH 8.0)， 1.5% SDS)加入到50^il的每一样品中后，将混合物在室温温育10分钟，然后在100'C温育12分钟。将细胞裂解物在14000xg(Eppendorf5415C) 离心5分钟，收集得到的上清液称为总蛋白质提取物。在SDS存在下，使用BSA作 为木示准，通过Markwell ((1978) A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples. Anal Biochena 87(1), 206-10)描述的方法，测定每一裂解物的蛋白质浓度。
[67]SDS-PAGE和免疫检测。将细胞裂解物（每泳道30吗）与样品缓冲液（125mM Tris/HCl， pH6.8; 4%SDS; 20mMDTT; 0.05%溴酚兰；20%甘油）混合，并煮沸 2分钟。蛋白质用SchSgger and von Jagow ((1987) Tricine國sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry 166(2), 368-79)中描述的SDS-10。/。聚丙烯酰胺凝胶 分离。使用半干转移系统（semi-dry transfer system)进行电印迹（Hoefer Semiphor unit),将蛋白质转移至Ulmmobilon-P膜（PVDF， Millipore)上。转移在含有10mM CAPS(pHll)， 10。/。(v/v)甲醇的缓冲液中进行30分钟，2.5mA/cr^凝胶表面积。电转 移完成之后，印迹用0.5%丽春红染色，以评价转移质量，并用Milli-(f-级水洗涤。 印迹用含有5。/。脱脂奶粉的TBST C150mM NaCl， 10mM Tris/HCl pH8， 0.05% Tween-20) (Harlow & Lane, supra)在4。C封闭过夜，然后用含抗-GumB (1:3000) 或抗-GumC (1:5000)抗体的、含有3M脱脂奶粉的TBST在室温下温育3h。碱性磷 酸酯酶结合的羊抗鼠IgG或抗兔IgG (Sigma)分别用于检测，如制造商所述。印迹 用TBST洗涤三次，然后在含氮蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（NBT/BCIP， Promega)的溶液中显影。可以使用商业上可获得的蛋白质标记MW-SDS-70L (Sigma)来校准SDS-PAGE。
[68]印迹定量分析。GumB和GumC蛋白质条带的强度通过用UVP摄像密度仪 (Densitometer) (UltraVioletProducts)扫描用NBT/BCIP显影的滤膜，而得以确定， 并用GelWorks 1D分析软件（NonLinear Dynamics Ltd)进行量化。每一滤膜含有 PRM-l(pBBR-prcm)提取物的参考泳道，以确定野生型细胞中染色体编码的GumB 和GumC的水平。观察到GumB和GumC的相对数量。参见图2A和2B。
实施例6—程序一使用原子力显微术测定分子长度或分子量
[69]使用称为原子力显微术（AFM)或扫描探针显微术（SPM)的直接观察技术 (direct visualization technique),对野油菜黄单胞菌菌株产生的黄原胶分子的长度
进行成像，这些野油菜黄单胞菌菌株携带（XWCMl/pBBR5-BC)或不携带 (XWCM1)多拷贝的gw/^和gwwC。用于进行AFM的程序将在下面详细描述。观
察到，由携带多拷贝的gw/^和gw附C的菌株产生的黄原胶分子的平均分子轮廓 (contour)长度比亲代菌株产生的要长得多。[70]通过将0.1g的胶混合在100g的蒸馏水中大约3小时，制备0.1wtn/。的胶溶液。通 过将20)il的0.1wtn/。溶液稀释入20g0.1M醋酸铵溶液，制备l ppm的lt存液。将2(Hi1 的l卯m贮存液喷洒到新鲜切割的云母片上（~lcm2)。这些云母片然后置于加热的 (〜60°C)真空室中〜1小时，以去除过量的水。干燥的云母片然后用AFM的轻叩 模式（Tapping Mode)进行扫描。用Digital Instruments提供的软件测量所有AFM图 像的分子轮廓长度。
[71]测量一群黄原胶分子的轮廓长度。该研究的结果总结于表4中。（每一尺寸级 别的分子小于或等于示出的长度；尺寸级别中示出的分子数量不包括纳入在更小
尺寸级别中的分子）。这些结果显示，由具有多拷贝的gww5和^mC的野油菜黄单 胞菌菌株产生的黄原胶分子明显大于由对照菌株产生的黄原胶分子。原子力显微 术（AFM)或扫描探针显微术（SPM)利用商业可获得的仪器（Nanoscope IIIa， Digital Instruments, Santa Barbara, CA),使用氮化硅悬臂尖（cantilever tip)进行。
表4黄原胶分子轮廓长度的AFM测定
XWCM1 长度* 分子 比例 分布
(计数） (%) No. Avg Wt.Avg
0.5 225 51.5 S 3
1 130 29.7
1.5 40 9.2 =99.8% =99.7%
2 25 5.7
2.5 13 3.0
3 0.7
3.5 0 0.0 > 3 |jjn > 3拜
4 0 0.0
4.5 0 0.0 =0.2% =1.3%
5 1 0.2
5.5 0 0.0
6 0 0.0
6.5 0 0.0
7 0 0.0
7.5 0 0.0
8 0 0.0
8.5 0 0.0
9 0 0.0
9.5 0 0.0
10 0 0.0
总量 437 0.0<table>table see original document page 21</column></row> <table>
实施例7—耐海水粘度评价
[72]评测由XWCM-l/pBBR5-BC菌株产生的黄原胶的耐海水粘度（SWV)，将之与 商业渠道获得的黄原胶产品（Xanvis™)进行比较。XanvisW黄原胶产品的典型的 SWV在18至22范围内。
[73]使用下述程序测定耐海水粘度。将41.95g的海盐（ASTMD1141-52，来自Lake Products Co, Inc. Maryland Heights, Missouri)溶解于l升的去离子水中，制备海水 溶液。将300ml的海水溶液转移到混合杯，该混合杯连接有Hamilton-Beach 936-2 混合器（Hamilton-Beach Div.， Washington, D.C.)。混合器速度控制被设置于低速， 并将单槽纹盘（single fluted disk)附着到混合轴（mixing shaft)。在低速设置时， 混合轴以近似4,000-6,000rpm的速度旋转。将0.86g的生物胶（biogum)在15-30秒 的时间里缓慢加入到混合杯，并允许混合5分钟。将混合器速度控制设置至高速
(ll,OOOil,OOOrpm)，允许测试溶液混合近似5分钟。从加入生物胶产品的时间算 起，混合物允许混合共45分钟。45分钟的混合时间结束时，加入2-3滴BaraDefoam
(NL Baroid/NL industries, Inc., Houston, TX)，并继续再搅拌30秒。
[74]将混合杯从混合器移去，并浸入冷却水，以将液体的温度降至25士0.5'C。为了确保溶液的均匀，冷却之后，在ll,000il,000rpm转速下，将溶液再次混合5秒钟。 将溶液从混合杯移至400ml的Pyrex烧杯，并测量Fann粘度（Fann Viscometer, Model 35A)。这通过在低速（约3ipm)下混合而完成。稳定读数，然后从表盘读出剪应 力值，作为3rpm转速时的SWV值记录下来。