串叶松香草提取SOD及植物SOD系列产品开发的可行性研究

                        左有权*   

        

摘 要： 串叶松香草（Silphium perfoliatum l.）是一种多年生、产量高、适应性强、叶蛋白含量丰富、SOD活性含量高的草本植物，是一种理想的植物原料药，具有重要的生物价值和医药临床应用价值。为了进一步深入研究串叶松香草的科学价值，本文综合概述了串叶松香草利用价值及串叶松香草SOD食品工业技术可行性研究。着重阐述了串叶松香草超氧化物歧化酶和植物叶蛋白系列产品生产工艺流程及特点、生产方法的技术改进应用和技术创新研究。本文对串叶松香草SOD提纯生物技术方法，基本类型和产品理化特性及结构，检测方法进行分析及提供适用于串叶松香草SOD准确检测方法的建议。串叶松香草SOD系列食品的开发和应用对改善人类膳食健康以及在生命科学和生物保健领域临床应用有着深远的意义。

关键词: 超氧化物歧化酶；临床；应用；串叶松香草；植物叶Silphium perfoliatum (SOD) & SOD Serial ProductsDevelopment Feasibility Study

                      ZUO Youquan* 

Abstract: Silphium perfoliatum is one perennial, high output, strong compatibility, rich leaf protein content, highly SOD active content herb and is one kind of ideal herb pharmaceutical materials, which owned the important biological and the clinical practice value. In order to further deep research the scientific value of Silphium perfoliatum, this article synthesis has outlined the feasibility research of Silphium perfoliatum value in daily use and SOD food industry technology. Mainly elaborated following several aspects: Silphium perfoliatum(SOD) technique of production flow and characteristic, producing method improvement and application, Silphium perfoliatum(SOD) technological innovation. This article carries on the analysis about Silphium perfoliatum(SOD) depuration biological technology method, fundamental type and product physics, chemistry characteristic and the structure, examination method. This article provides suggestion on Silphium perfoliatum(SOD) accurate examination. The Silphium perfoliatum(SOD) series food's development and application improved the human health as well as have the profound significance in the life sciences and the biological health care domain clinical practice.

Key Words: SOD; clinic; application; Silphium perfoliatum l；LPC

Chinese Library Classification(CLC):R      Document code:A

Article ID:1673-6273(2010)

1 概述

     串叶松香草（Silphium perfoliatum l.）又名法国香槟草[1]

属菊科多年生草，株高2.0--3.5米，是原生长于美国的一种牧草，是北美印第安人的传统草药，1979年由北京植物园从朝鲜引进，中国农业科学院试种成功。 串叶松香草多年生、产量高、适应性强、叶蛋白含量丰富、SOD活性含量高的草本植物，是一种理想的植物原料药。M.Grieve 所著《现代草药》报道,串叶松香草的根可入药，用做强壮剂或补剂、具有抗疲劳、改善体质的作用，具有利尿、发汗、补虚的作用，其粗蛋白含量接近或超过豆科植物，占干重的17.83%-20%，从串叶松香草中提取浓缩后的蛋白质含量高达80%以上，其氨基酸组成合理，有人体必须的八种氨基酸。串叶松香草其本身对顽咳、哮喘、肺、肝以及内伤、溃疡各类杂症等均有疗效，在民间常用于沐浴、熏蒸、治伤风感冒等各种保健药用及疾病治疗的传统中草药。西北大学测得，串叶松香草含有人体所需要的全部必须氨基酸，其氨基酸组成优于联合国粮农组织的标准模式。尤其是限制性氨基酸赖氨酸和超氧化物歧化酶（SOD）[2]的含量特别高，因此生物价值很高。

自1994年12月全国首届叶蛋白学术研讨会在长沙召开，在党中央、国务院关于加强科技创新，发展高科技，实现产业化方针政策的指引和全国中蛋白会议35位专家教授论证的启示下，串叶松香草的应用价值得到首肯和支持。生物医药及化工方面的专家教授研究表明，直接从串叶松香草植物的鲜茎叶提取的蛋白制品，是无毒无害的天然高级营养食品。其串叶松香草高含量的超氧化物歧化酶（SOD）具有保健功能和药理作用，制成超氧化物歧化酶（SOD）药物胶囊，其临床效果十分显著。因此串叶松香草叶蛋白（LPC）和超氧化物歧化酶（SOD）[3]的研究开发于2001年被国家计委、科技部列入中国高新技术产业化重点项目。1995年湖南省沅江市科学爱好者秦和沅试种串叶松香草成功，并深入研究叶蛋白和SOD。1997年7月2日《人民日报》以“这场革命静悄悄”为题，报道了全国串叶松香草协作组长、中国科学院植物研究所袁国弼答记者问，串叶松香草具有生长快、再生力强、营养价值高等特点。由于疯牛病的影响，欧盟从1997年1月起禁止使用动物SOD，国内外专家学者把眼光投向植物SOD领域，植物SOD 的开发研究开始彰显其重要性。我国近年来在植物SOD 的研究领域有大量相关进展报道。其中全国植物SOD工业化生产技术先驱者秦和沅教授 [4]，经过10多年的研究，成功的从串叶松香草中提取了超氧化物歧化酶（SOD）从根本上克服了动物超氧化物歧化酶病毒交叉感染的弊病。2002年11月4日，该研究成果已通过湖南省科技厅鉴定，认为该研究项目“属国内首创，属国内领先水平。”植物SOD的应用开发成为当今SOD领域的研究主流。

2 串叶松香草SOD提取技术应用

秦和沅教授 [4]采用一项“食用叶蛋白加酸加热沉淀生产法”专利号为ZL0012663507，国际专利主分类号A23J3/14和“一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法”[5]，专利号CN02129912.9。该技术利用的试剂安全可靠，无任何副作用及残留污染。其发明属国内首创：与其他生产法比较特点主要表现为：具有工艺简单、沉淀速度快、效果好、不需增加特别的设备、不受规模限制等特点，适应于自动化生产用，采用本方法沉淀时间只需常温加酸法的1/3－1/4，沉淀效果优于常温加酸法。其创新点和发明的核心关键技术在中国是一大突破，省时、工艺简单、节能、沉淀效果好，适应自动化大生产等特点，不仅对引领国内行业技术进步具有重要意义，而且在国际上也属一流技术。

3 串叶松香草SOD提取纯化工业技术应用研究

3·1 串叶松香草植物SOD系列产品工业化生产技术

由于目前市场上大多SOD都是实验试产品，生产技术大同小异，SOD 活性测定方法不统一，因此未能进行横向比较研究，难已运用于工业化生产。SOD的提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等，但大多都局限于SOD稳定性产品的批量生产。秦和沅 [2]的SOD加酸加热沉淀生产法属工业化技术首创，该技术于2002年运用于实际生产，其企业执行标准（中间体）Q/NWEV002-2002。

串叶松香草植物SOD原料生产总体工艺技术流程图示如下：

串叶松香草SOD系列产品生产工艺流程如下：

来自基地的串叶松香草,经清洗干净后，采用专用设备捣碎至符合工艺要求，送入榨汁机榨汁，得到的新鲜草汁经粗滤、精滤、微孔过滤，得到清汁液，清汁液作为生产SOD饮料的原料；榨汁后的汁，经过分离纯化、调温、调PH值、盐析沉淀，得到叶蛋白和上清液、榨汁后的残渣用于生产饲料；叶蛋白经过浓缩、喷雾干燥，制得叶蛋白粉。再从上清液中提取超氧化物歧化酶经精制、分离，得到SOD。超氧化物歧化酶SOD中间体原料可作为深加工成SOD药用胶囊、SOD口服液、SOD化妆品等产品，剩下的渣料用来酿酒，酿酒后的渣用来喂猪养鱼，实现了串叶松香草的深加工、全利用，形成绿色产业链。

3·2串叶松香草SOD二次加工植物食用酶制剂精确流速自动化分离分级生物技术

秦和沅 [4]、秦建良[5]在SOD加酸加热沉淀生产法的基础上对植物SOD提取方法进行技术创新改造属二次加工工艺，利用分离纯化SOD的方法及分级提取三种不同类型SOD的基本性质进行了研究。一方面为了更彻底地了解串叶松香草中的成分，优化产品结构，提高产品品质；另一方面对研究了串叶松香草在原粗提SOD的技术基础上利用高效工业化SOD生产的分离分级生物提取技术运用于实际生产的实验方法。

植物食用酶制剂精确流速自动化分离分级技术工艺技术方法如下： 1．将串叶松香草中的叶子洗净、擦干，获得上清液，加入按一定比例磷酸盐缓冲液进行组织捣碎SOD粗酶液，高速离心；将提取液用丙酮使SOD粗蛋白沉淀、静止，低速离心；将沉淀用蒸馏水充分溶解，55℃水浴中加热15min，离心除去部分杂蛋白，获得粗酶液。将粗酶液过DEAE-琼脂糖柱层析，用pH7.6，0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液进行洗脱，洗脱速度控制在5ml/min，以每管5 ml收集洗脱物，得三个活力峰，分别收集、透析、干燥浓缩后；按与DEAE-琼脂糖柱层析后同样的方法收集处理,将收集SOD活性峰的部分合并，测定蛋白峰处各管的酶活力(U)及蛋白质含量(mg)。将收集的酶液蛋白质，4℃透析，用冷冻干燥机将酶液蛋白质制成干粉。2．分级得到SOD-Ⅰ，SOD-Ⅱ，SOD-Ⅲ三种同工酶[7]将第二次得到的干燥的SOD进行同工酶电泳及活性染色、等电点聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳精确流速分离纯化SOD，通过凝胶过滤法测得SOD－I的分子量约为46 000 D，SOD－11的分子量约为35000 D子量为，SOD－Ill分子量约为 40 000 D。把通过凝胶过滤的 SOD－I、SOD－11、SOD－Ill酶，进行 SDS－聚丙烯酞胺凝胶电泳（SDS－PAGE）测得串叶松香草中均由两个相同的亚基组成.由此可见串叶松香草里面 Cuzn－SOD里的含量最多，定位于细胞质以及叶绿体和线粒体外膜之间。这两种结果进一步证明串叶松香草中的SOD蛋白质性质为铜锌结构即Cuzn/SOD；（如图1）两个亚基主要通过疏水和静电相互作用结合在一起。铜和锌则与活性位点上的组氨酸侧链形成配位键。等电点聚焦电泳进一步证实串叶松香草中的三条同工酶完全分离纯化.SOD-Ⅰ纯化倍数为80.1，活性回收率为5.4％；SOD-Ⅱ纯化倍数为253，活性回收率为25.6％；SOD-Ⅲ纯化倍数为90.6，活性回收率为5.2％。由此可知利用此法SOD-Ⅱ纯化倍数及活性回收率在三个同工酶中最高，此类型SOD可以批量生产且每批次SOD酶活性误差低于3%。国内洪元公司植物型Cuzn/SOD3000IU/mg蛋白规格已投入批量生产。

4 串叶松香草SOD活性检测方法、产品特性

4·1 串叶松香草SOD活性检测方法

国内SOD测定方法(大约有20多种），常用的检测方法有肾上腺素自发氧化法、邻苯三酚自氧化法、细胞色素还原法、黄嘌吟自氧化法、亚硝酸法、辣根过氧化物酶法、亚硫酸盐法、化学发光法、NBT法等。其中国内最早对串叶松香草SOD活性检测的单位湖南沅江洪元植物叶蛋白开发有限公司分别通过肾上腺素自氧化法、邻苯三酚自氧化法[8]两种方法进行过检测。2002年1月29日提供SOD样品由湖南公共卫生检测检验中心通过肾上腺素法测得SOD酶活性为4076IU/mg。2003年12月1日提供SOD样品由中国科学院微生物研究所张博润通过邻苯三酚法和SOD蛋白谱带分析测得SOD干粉活性为2100IU/mg（较强）。串叶松香草草苗SOD活性180IU/g。由于串叶松香草SOD酶活性中表达存在一定的特殊性,建设寻找准确的活性模拟物或底物替代,进一步探索和研究适合串叶松香草SOD活性检测的最佳方法.

4·2 串叶松香草SOD产品特性

超氧化物歧化酶（SOD）精粉(120-200目),ECl.15.1.1：是从串叶松香草植物的鲜叶茎中提取的一种极好的水溶性蛋白。分子量为32～36Kd（凝胶过滤法），由两个亚基组成,每个亚基含一个铜原子和一个锌原子，属Cu.Zn-SOD（图2），Cu.Zn-SOD的活性中心是组氨酸61（His61 ）的咪唑基为桥Cu、Zn异双核基团（如图2 所示）。具有对PH、热和蛋白酶水解比一般酶稳定的特性，SOD蛋白易溶解于水，溶解性≥90%，具有抵抗蛋白质的水解作用可以经肠胃吸收。体内半衰期≥24H（SOD为7.6min）、热及水溶液中的稳定性：串叶松香草SOD（MSDS化学品安全测试）ｐＨ值7.8～9.0，T=88℃，溶解时间为（15～30min)稳定性是普通SOD的3倍，对皮肤无刺激性和过敏反应（克服了异源蛋白质的免异源性）。无毒、无害且安全。无毒性：LD50＞10000μ/kg(国家标准),干燥常温下36月以上不失活性，冷冻不得低于4℃。

     串叶松香草Cu.Zn-SOD催化过程中咪唑桥与Cu2＋的氧化和还原的关系图（图2）

5 串叶松香草SOD产品开发及临床应用

5·1 串叶松香草SOD产品开发

   串叶松香草还含有丰富的人体必须的脂肪酸、矿物质、微量元素和维生素，其钙、磷的含量分别为干重的3，22%、0，28%；其微量元素如锌、铁、锰、硒等，维生素如胡萝卜素A和维生素C含量丰富，这些营养成分具有防病、治病、强身、健体、防衰老等多种生理功能。利用串叶松香草提取的SOD加工成系列产品用途主要是在保健食品及化妆品方面。张晓燕[9]食品应用研究表明SOD可用来作为强化一些食品的保健功能或用来作化妆品的添加剂。目前已开发的保健食品有添加SOD的蛋黄酱、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、奶糖、酸牛奶等以及利用富含SOD的原料开发的天然保健食品如芦荟汁、刺梨汁、大蒜素、香蕉汁、猕猴桃汁、菠萝汁、山楂汁、麦绿素等。另外利用串叶松香草SOD开发出了SOD粉剂、SOD口服液、SOD胶囊、SOD霜[10]、SOD脂质体[11]、注射用超氧化物歧化酶（SOD）[12]等功能性保健食品和美容化妆品。 

5·2串叶松香草SOD产品临床应用

初步医药临床及市场证明串叶松香草SOD具有以下效果：

1）串叶松香草SOD具有抗炎、抗病毒感染；抗免疫性疾病、抗肿瘤、抗心脑血管疾病[13]、抗辐射、抗氧中毒、抗白内障、抗休克、抗心脑（脑 肾)缺乏再灌流综台症等疾病的辅助治疗。

2）串叶松香草SOD用于治疗器官移植过程中产生的合并症．对肺气肿病人在肺组织中弹性纤维尚未遭受严重损伤的情况下，使用串叶松香草SOD效果明显。

3）对类风湿性关节炎[14]，红斑、疮，皮肤炎[15]等，可用串叶松香草SOD治疗，可使病情缓解。

4）使用串叶松香草SOD可预防老年性白内障的形成。

5）串叶松香草SOD具有一定的抗过敏作用SOD外用制剂对接触性皮炎的有效率为75%，对目光性皮肤炎的有效率为100%，对湿疹的有效率为60%，对脂溢性皮炎的有效率为77％，对玫瑰痤疮的有效率为1O0％。

6）串叶松香草SOD对预防癌症和治疗癌症，化疗引起的并发症，有良好效果。

 通过专家组论证从串叶松香草提取的植物SOD是一项具有强大生命力的高科技生物技术产品。其应领域[ 17]：一是在医学临床上治疗癌症、炎症、高血压、心脏病等上百种疾病有显著疗效；二是对皮肤创伤、烧伤、烫伤及各种疱毒的治疗有独特作用，尤其对防衰老作用显著；三是植物SOD可直接作为功能性食品，提高人体免疫功能；四是植物SOD是美容护肤和食品、饮料最好的添加剂；五是植物SOD还具有维生素E、维生素C及绒毛膜促进激素等多种原料成份，植物SOD通过提取蛋白及蒸煮酿酒后的原料，其蛋白质成份不低于20%左右，因此，通过提取叶蛋白后的原料可作为家禽、家畜的上等饲料，此饲料经专家论证，除正常食用功能外，还能增加动物的免疫功能，特别是抗疫禽流感及多种疫病。

    综上所述，串叶松香草的应用价值是不可估量的，特别是植物叶蛋白和植物SOD的利用开发，采用高技术实施新型资源深加工产业化带来巨大空间。串叶松香草深加工技术产业化示范项目的SOD系列产品，是有益于人们身体健康的天然营养型绿色保健品。串叶松香草原汁液、叶蛋白、植物SOD在现代工业食品、医药、日化、保健品行业有广泛的用途，对植物SOD、汁液、叶蛋白等产品进行深加工可获得更高的附加值，从而带动这些行业的发展。

参考文献（References）

[1]袁国弼.串叶松香草文集[M].太原.山西省生物研究所 1988

[2]袁勤生.超氧化物歧化酶[M].上海.华东理工大学出版社 2009，5

 [3]刘文海. 串叶松香草的新用途—提取SOD开发叶蛋白[J]. 现代生物医学进展 2008年第11期

[4]秦和沅.植物食用叶蛋白及SOD生产方法[P]. 专利技术, CN1348702，2002.05.15

[5]秦和沅 秦建良.一种从植物中提取超氧化物歧化酶的方法[P]. 专利技术, CN02129912.9 ，2004.02.25

[6]左有权.植物食用酶制剂精确流速自动化分离分级提取SOD的可行性研究[J]. 现代生物技术, 2010，6  

[7]陈淮扬 刘望荑. 从SOD 的分布与结构看其分子进化[J]生物化学与生物物理进展,1996 ,23(5):408 412

[8]张博润 习爱坡 欧阳京 两种简便又较为准确检测SOD酶活性的方法[J].微生物学通报, 1997年，24（3）  [9]张晓燕 超氧化物歧化酶的研究现状及在食品中的应用综述[J].扬州职业大学学报, 2002,6（1）：34-37

[10]张利加 陈雯辉 SOD霜的制备及临床应用[J].中国预防医学杂志2OO3年5月第4卷第2期

[11]张立军 陈红漫等 一种玉米SOD脂质体及其制备方法[P]. 专利技术 200510047864，2006.8.9

[12]张天民 合作研制药用超氧化物歧化酶回忆[P].食品与药品 2009年第11卷第11期

[13]郑玉云，张朝，郭晓华，等.超氧化物歧化酶和丙二醛在几种心血管疾病中的变化[J].包头医学院学报，2002，18（3）：175-176.

[14]左晓霞，段力平，曹治函等.Cu,Zn-SOD治疗类风湿关节炎临床研究[J].湖南医科大学学报，1995，20（3）：275-277.

[15]Diehl C, Lipozencić J, Ledić-Drvar D. The basis of topical superoxide dismutase antipruritic activity[J]. Acta DermatovenerolCroat, 2009, 17(1): 25-39.

[ 16]J. Hollander, J. Bejma, T. Ookawara, H. Ohno. Superoxide dismutase gene exp ression in skeletalmuscle: fiber - spe-cific effect of age. Mechanisms of Ageing and Development, 116 (2000) 33 - 45.

[ 17] CHEN Mian, ZHU Xi-qiang  Research and Application of Superoxide Dismutase in Clinic [J] Food and Drug  (2009)11-09